IŞIK MİKROSKOPLARI
En iyi bilinen ve mikrobiyolojide en sık kullanılan mikroskoplardır. Öğrenci mikroskopları olarak da en kullanışlı ve ucuz olanıdır.
Toplayıcı mercek (kondansatör )
Ayna ile tabla arasında bulunan ve ışınları toplayıp optik sisteme yoğun olarak ileten mercek sistemidir. Aşağı yukarı hareket edebilir.
Aydınlık alan mikroskoplarında görüntü
Işık kaynağından gelen ışık önce kondensör lenslerini geçerek numuneye doğru gelir. Daha sonra objektif lensleri ve ikincil büyütücü lensleri içeren oküleri geçer göze yönelir.
Hayalin büyütülmesi basitçe objektif lenslerinin büyütmesidir.
Bir objektifin büyütmesi bağlı bulunduğu tüpün mm cinsinden uzunluğunun, odak uzunluğuna bölünmesi ile bulunur. Mikrobiyolojide kullanılan objektiflerin odak uzaklığı 2mm, 4mm ve 16mm uzunluğundaki objektiflerdir. Standart olarak tüp uzunlukları 160 mm veya eşdeğeridir. Odak uzaklığı 16 mm olan bir objektifin büyütmesi (160/16=)10, odak uzunluğu 4 mm olan bir objetifin büyütmesi (160/4=)40 olacaktır.
ışık mikroskopunda en iyi ayırt edici (çözücü) güç 0.2 μm dir.
En iyi aydınlatma
Yüksek büyütmelerde, yüksek şiddette aydınlatma oluşturmak gereklidir (100X ile bakarken gibi) .
Düşük büyütmede daha az ışık daha iyi görünüm sağlar. Örneğin 40X de bakarken az ışık daha iyi görünüm sağlar.
Boyasız preparat:
Önce kondansatör aşağıda, ışık kısık 10x objektifle belirli bir görüntü elde edilir. Sonra sıra ile daha büyük objektiflere geçilir. (daha çok 40 lık).
Boyalı preparat
Kondansatör yukarda , diyafram tam açık, ışık açıktır. 20x yada 40X ile başlanıp 100x ile (immersiyon kullanılarak) incelemeye devam edilir.
İmmersion mikroskopisi
Bir mikroskobun çözme gücü, aydınlatmak için kullanılan ışığın dalga boyu ve objektif merceğe giren ışığın açısı (sayısal açıklık olarak adlandırılır) ile belirlenir. 100X objektifle incelenirken preparata bir damla immersiyon yağı damlatılır.
Işığın hava ile temasını kesilir. Böylece cam-hava- cam aşamasındaki kırılmalar önlenir. Işık dağılımını azalır. Çözme gücü en yüksek hale gelir.
Kullanıcıya uyarılar:
Mikroskopların her parçası son derece pahalıdır.
Mikroskop ayak kısmından sıkıca tutularak taşınır.
Taşımak için asla oküler kısmından tutulmamalıdır
Mikroskobun konulduğu masa sağlam, sallantısız, olmalıdır.
Oturulacak tabure rahat, yüksekliği ayarlanabilen nitelikte olmalıdır.
Odaklama düğmesini nazik kullanılmalıdır.
İnceleme bittikten sonra preparatlar antiseptikli eriyiğe atılır.
Mikroskobu kaldırmadan önce mutlaka objektifleri tüm optik mercek sistemleri ve preperat koyma yerleri dikkatle temizlenmelidir.
Lensler özel lens temizleyiciler yada distile su ile temizlenir.
Kulllanılmadığı zaman mikroskop plastik veya kumaş bir örtü ile örtülür yada kutusuna yerleştirilir.
KARANLIK ALAN MİKROSKOPİSİ
Treponema, leptosipira gibi çok ince yapılı mikroorganizmalar ışığı fazla kırdıkları için normal ışık mikroskoplarında göremeyiz.
Bu mikroorganizmaları ve bakteri hareketlerini görmek için karanlık alan mikroskobu kullanılır. Karanlık alan mikroskobu ile ışık mikroskopunun farkı sadece kondansatör farklılığıdır.
Çalışma sistemi:
Işınları oblik yansıtan bir kondansatör kullanılır.
Işınlar yanlara doğru yansıtılıp objektife doğru yansıtılmadıklarından mikroskoba bakıldığında görüntü alanı karanlık görülür.
Sadece incelenen preparatta bulunan mikroorganizmalar kendilerine gelen ışınları yukarı yansıttıklarından, siyah zeminde parlak alanlar olarak görünür hale gelirler.
karanlık alan mikroskopunda ayırt edici güç daha iyidir. 0.02 μm ye düşer
FLORESAN MİKROSKOP
Cisimlerin gelen ışınları gelişinden farklı dalga boyunda yansıması olayına florasans denir.
Bazı maddeler kısa dalga boyundaki ışığı absorbe edip, daha yüksek görünür dalga boyunda ışık olarak tekrar yayınlarlar. Bunlara floresans madde denir.
Ultraviyole gibi görme sınırımız dışında kalan bir ışık, floresan madde tarafından absorbe edilip, görülebilen ışık spektrumu içinde bir dalga boyunda yansıtıldığında, görünür hale gelir.
Preperatlar floresans veren boyalarla boyanır. Rodamin (pembe), auramin, flurescein (yeşil), Etidyum-Bromür (altın sarısı), gibi.
Mikroskopda, geleneksel ışık mikroskoplarının yaydığından daha kısa dalga boyunda ışık yayan yüksek basınçlı cıva, halojen veya ksenon buhar lambası kullanır.
Lambadan üretilen ısıyı engellemek, kızılötesi ışığı ortadan kaldırmak, florokromu uyarmak ve uygun dalga boyunu seçmek için bir dizi filtre kullanılır. Florokromdan yayılan ışık daha sonra geleneksel objektif ve oküler lenslerle büyütülür.
Florokrom boyanmış organizmalar ve örnekler, koyu bir arka plana karşı parlak bir şekilde aydınlatılmış görünür.
FAZ KONTRAST MİKROSKOPİSİ
Sıvı bir ortamda canlı olarak incelenen mikroorganizma ve özellikle hücrelerin, iç yapılarının görülmesi güçtür.
Hücrenin stoplazması ile hücrelerin bulunduğu sıvı ortamın, ışığı kırma indeksleri arasında büyük bir fark yoktur.
Faz kontrast mikroskobunun özel kondansatör ve optik sistemi vardır. Sıvı ortamdaki mikroorganizmaları boyamadan farklı yapıları arasında faz ve kontrast farklılığı oluşturarak onların morfolojisi, kapsülü, kirpiği, sporu hakkında bilgi edinmek için kullanılır.
ELEKTRON MİKROSKOBU
Elektron demeti ışık kaynağının, elektromanyetik çubuklar lenslerin yerine kullanılır. Bu sistem vakum ortamına oturtulmuştur.
İncelenecek cisimler cam elektronları geçirmediği için selülöz tabaka yada kafes üzerine yerleştirilir.
Çok daha kısa bir ışık dalga boyu kullanıldığından, büyütme ve çözünürlük önemli ölçüde iyidir.
Virüsler (viral inklüzyon cisimlerinin aksine) elektron mikroskobu ile görülebilir.
Numuneler genellikle kontrast oluşturmak için metal iyonları ile boyanır veya kaplanır.
Dışardan bir pencere aracılığı ile gözlenir.
Bu büyütme 2 000-100 000 arasında olabilir.
Dışardan bakmak için mercek sistemi kullanılırsa 20 000-1 000 000 kez büyütme elde edilebilir.
Transmission electron microscopy (TEM)
Elektronlar doğrudan numuneden geçer. Hücre içi yapıları gösterir.
Numuneler çok ince kesilmeli ve elektronları dağıtan metallerle muamele edilmelidir.
Scanning Electron Microscopy (SEM)
Elektronların numunenin yüzeyinden belirli bir açıda yansır ve üç boyutlu bir resim oluşur.
Bu türde büyütme düşüktür. Fakat nisbeten geniş olan objelerin yüzeylerini gözlemlemek için iyidir. İnce kesmek gerekli değildir.
